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生物检验中两重要试剂应用点评

作者:无锡市北高中 来源:无锡市北高中 发布时间:2012年02月27日 点击数:

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用“新制的Cu(OH)2 (斐林试剂)”鉴定可溶性还原糖与用“双缩脲试剂”鉴定蛋白质的实验是中学生物检验中的重点内容,为便于学生理解和掌握,现归纳总结如下。

1.原理

(1)可溶性还原糖鉴定原理

利用化学中醛基(-CHO)、半缩醛羟基的还原性,在加热的条件下,可将氢氧化铜还原为砖红色的氧化亚铜沉淀,而还原性糖本身则被氧化为相应的有机酸。以葡萄糖为例,其反应式如下:

CH20H-(CHOH)4-CHO+2Cu(OH)2   CH20H-(CHOH)4-COOH +Cu2O↓+2H2O

而可溶性还原糖如葡萄糖、果糖、麦芽糖等的分子中含有的具有还原性的半缩醛羟基,当与新配制的一定浓度的 Cu(OH)2悬浊液混合后,就发生如上反应 。

(2)蛋白质的鉴定原理

在碱性溶液中,双缩脲(H2NOC-NH-CONH2)能与Cu2+ 作用,形成紫色或紫红色的络合物。故双缩脲试剂可鉴定双缩脲的存在,而蛋白质分子中含有很多与双缩脲结构相似的肽键。因此,蛋白质都可与双缩脲试剂发生颜色反应。

2.试剂的配制

(1)斐林试剂的配制

甲液:质量浓度为0.1g·mL-l的NaOH溶液

乙液:质量浓度为0.05g·mL-1的 CuS04溶液

使用时临时配制,将4~5滴乙液滴入 2mL甲液中,振荡混合均匀后即可使用。关键是注意NaOH要过量。

(2)双缩脲试剂的配制

取10gNaOH放入烧杯内加水 100mL,待充分溶解后倒入试剂瓶中配制成质量浓度为0.1g·mL-1的NaOH溶液,瓶口塞上胶塞,贴上标签,写上试剂A。

取1 g CuS04放人烧杯中,加水 100mL,待充分溶解后倒入试剂瓶中配制成质量浓度为0.01g·mL-1的CuS04溶液,瓶口塞上胶塞,贴上标签,写上试剂B。使用时,先向试管中加入2mLA,再向试管中加入3~4滴B,摇荡均匀即可。

3.实验现象

(1)斐林试剂鉴定还原糖的实验

因先加入刚配制的Cu(OH)2溶液变成浅蓝色;加热后,部分Cu(OH)2被还原为砖红色Cu20,因二者混合故呈现棕色;随着反应的继续进行,Cu(OH)2被全部还原为Cu20,故出现砖红色的沉淀。颜色变化为:“浅蓝色→棕色→砖红色(沉淀)” 。

(2)双缩脲鉴定蛋白质的实验

加入双缩脲试剂A,溶液为无色:加入双缩脲试剂B,因有Cu(OH)2生成,故呈现浅蓝色;振荡均匀后,由于反应的进行,出现紫色的混合物。

颜色变化为:“无色→浅蓝色→紫色”。

4.试剂使用中注意的几个问题

新制Cu(OH)2

(1)新制Cu(OH)2试剂为何要现配现用?

因斐林试剂很不稳定,容易生成蓝色Cu(OH)2沉淀,所以应将甲液、乙液分别配制储存,使用时再临时配制。

(2)斐林试剂鉴定时,为何不能先加入NaOH,后加入CuSO4而必须混合后再加入?

因为若先加入NaOH,还原性糖中的还原性半编醛羟基易被氧化而失去还原性,再加入CuS04后不能产生Cu2O沉淀;只有将其新配成Cu(OH)2悬浊液,才可产生砖红色沉淀。

(3)在做实验时,为何一般不选用双子叶植物的叶片和单子叶植物(如韭菜,鸢尾)的叶片?

由于在双子叶植物中,光合作用的主要产物葡萄糖形成后合成为淀粉,暂时储存在子叶内,因此最好不用双子叶植物的叶片作实验材料,在单子叶植物如韭菜、鸢尾,并不将光合作用的初始产物转变为淀粉,因此叶内含有大量的可溶性还原糖,但是,由于叶片中叶绿素的颜色较深,对于鉴定时的颜色反应起着掩盖作用,导致实验现象不明显,因此也不选用单子叶植物的叶子。

双缩脲试剂

(1)在使用双缩脲时,为什么要先加入试剂A,后加入试剂B? 

 先加入试剂A,造成碱性环境,而只有在碱性环境中,蛋白质才容易与Cu2+发生颜色反应。

(2)若加入试剂A后,为什么只能加入 3-4双缩脲试剂B,而不能加过量?

因为若加入过量的双缩脲试剂B, CuSO4在碱性溶液中生成大量的蓝色 Cu(OH)2,沉淀,会遮蔽实验中所产生的紫色,影响观察结果。

 

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